免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)科學(xué)研究領(lǐng)域難以替代的重要實(shí)驗(yàn)方法。通過將“可以與待測(cè)分子結(jié)合的特異性抗體”和“易于被檢測(cè)到的標(biāo)記物”二者相偶聯(lián)的方法，研究人員已經(jīng)獲得了高效且特異檢測(cè)樣本中靶標(biāo)的有效工具。而且隨著檢測(cè)手段的更新迭代，越來越多的標(biāo)記物類型也花樣翻新，大有“亂花漸欲迷人眼”之勢(shì)。那么，如何才能在種類繁多的抗體偶聯(lián)物中找到合適自己的那一個(gè)呢？今天就讓我們?yōu)槟銚荛_迷霧，一探究竟。
其實(shí)，作為標(biāo)記的偶聯(lián)物種類雖多，但其實(shí)最常用偶聯(lián)物只有3個(gè)大類，即：酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記和生物素標(biāo)記。
酶標(biāo)記的首選毫無疑問是辣根過氧化物酶 (HRP) 。HRP能通過催化有過氧化氫參與的一系列氧化還原反應(yīng)并釋放信號(hào)，而被廣泛應(yīng)用于免疫印跡 (WB), 酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA), 以及免疫組織化學(xué) (IHC) 等實(shí)驗(yàn)中。由于HRP自身穩(wěn)定性強(qiáng)且催化效率高，因此可以通過很簡(jiǎn)單的操作，有效放大中低豐度靶標(biāo)的信號(hào)，因此能夠適應(yīng)大多數(shù)檢測(cè)情境。酶標(biāo)記中的另外一種是堿性磷酸酶 (AP) 標(biāo)記，常常是通過催化磷酸酯底物的去磷酸化顯色反應(yīng)而達(dá)到檢測(cè)目的。與HRP相比，AP標(biāo)記過程中酶活性損失更大、穩(wěn)定性低且反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，因此對(duì)制備和檢測(cè)操作都提出了較高要求。但是得益于AP獨(dú)特的最適pH和催化穩(wěn)定性，這使得AP在堿性條件或?qū)Y(jié)果穩(wěn)定性要求苛刻的特殊場(chǎng)合下，具有比HRP更好的工作性能。
HRP標(biāo)記往往是樣本單靶點(diǎn)檢測(cè)的首選，但當(dāng)需要對(duì)同一樣本中的多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行多通道檢測(cè)時(shí)，熒光標(biāo)記抗體則提供了一種更好的選擇。各類熒光標(biāo)記，如：AF系列、Cy系列、FITC、羅丹明等為研究人員們提供了極大地選擇空間，因此被廣泛應(yīng)用于免疫熒光染色 (IF), 流式細(xì)胞術(shù) (FC), 和熒光免疫印跡 (FWB)實(shí)驗(yàn)中。選擇熒光標(biāo)記時(shí)，熒光相對(duì)強(qiáng)度和光譜分離度的選擇最為重要。由于激光光源、檢測(cè)設(shè)備等的不同，不同的熒光標(biāo)記在不同的設(shè)備上具有不同的熒光強(qiáng)度。因此，選擇熒光標(biāo)記物時(shí)，需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的特點(diǎn)和蛋白豐度，以確保最亮的標(biāo)記物和表達(dá)水平最低的蛋白相互組合。此外，“串光”問題會(huì)在熒光實(shí)驗(yàn)中帶來非常大的不利影響，并直接影響結(jié)果的可信度。因此，熒光標(biāo)記物發(fā)射光譜應(yīng)盡可能地彼此遠(yuǎn)離，以避免鄰近通道間熒光信號(hào)的串?dāng)_。如果難以確認(rèn)最佳熒光標(biāo)記的種類，優(yōu)先去嘗試AF488, Cy5, FITC, PE等文獻(xiàn)中最常用到的熒光標(biāo)記通常是較為穩(wěn)妥的選擇。
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