Western Blot除了能證明某樣品中含有某種蛋白之外，其最為重要的作用是比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少——即為蛋白表達(dá)水平最直接的證據(jù)。要衡量蛋白的表達(dá)水平，前提條件就是等量的上樣量。內(nèi)參的意義就是保證上樣量的一致。
內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物。
選擇內(nèi)參抗體應(yīng)遵循的原則
1、樣本來源
?哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞：β-Actin、β-Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等；
?植物樣本：plant actin、Rubisco 等；
?其他來源樣本，應(yīng)參照已發(fā)表文獻(xiàn),選擇合適蛋白作為內(nèi)參。
2、目的蛋白定位?全細(xì)胞蛋白和細(xì)胞質(zhì)：β-Actin、beta Tubulin、GAPDH 等；
?細(xì)胞核蛋白：PCNA、LaminA、LaminB、HistoneH3，K70、K80、Erk2、TATAbindingprotein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等；
?胞膜蛋白：Na(+)/K(+) ATPase 等；
?線粒體蛋白：VDAC1、COXIV等；
?血清：Transferrin等。
3、目的蛋白分子量目的蛋白分子量最好能與內(nèi)參蛋白分子量相差 5kd 以上，各內(nèi)參蛋白分子量詳見下方匯總表。
Tips: 內(nèi)參的選擇還需要考慮實(shí)際的試驗(yàn)環(huán)境：
★在做多組織多細(xì)胞樣本對(duì)比表達(dá)量時(shí)，最好選用 GAPDH作為內(nèi)參，因?yàn)镚APDH是代謝類蛋白，在活組織中表達(dá)比較恒定。而β-Actin和β-Tubulin是結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)有差異性；
★而在某些細(xì)胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會(huì)導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高，不適合做內(nèi)參；
★涉及細(xì)胞增殖的相關(guān)試驗(yàn)中，c-Jun由于自身表達(dá)變化不適合做內(nèi)參；
★凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)，TBP、Lamin等也不適合作為內(nèi)參；
★做誘導(dǎo)后樣本或檢測(cè)磷酸化等修飾性抗體時(shí)，應(yīng)選擇結(jié)構(gòu)蛋白作為內(nèi)參，如β-Actin 和β-Tubulin。
★做各種分泌液樣本的時(shí)候，如血漿、乳汁、組織液等，由于沒有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只能選擇一些分泌蛋白作為內(nèi)參。
※ 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的時(shí)候應(yīng)該考慮實(shí)際的實(shí)驗(yàn)因素并查詢相應(yīng)文獻(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)過程中也應(yīng)該注意內(nèi)參表達(dá)是否出現(xiàn)異常。
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