Cell 引用解析 | 清除白血病干細(xì)胞藥物有望開(kāi)發(fā)
《細(xì)胞 ? 干細(xì)胞》（Cell Stem Cell，IF: 23.393）近日發(fā)表了由美國(guó)愛(ài)荷華大學(xué)Hai-Hui Xue教授與Chen-Zhao教授合作完成的，關(guān)于清除白血病干細(xì)胞的最新研究成果。該成果闡明了前列腺素（PGE1）及其類(lèi)似物通過(guò)激活EP4受體進(jìn)而抑制導(dǎo)致白血病干細(xì)胞(LSCs)增殖的AP-1因子；這為進(jìn)一步設(shè)計(jì)并殺傷LSCs提出了新的學(xué)說(shuō)。
本文根據(jù)作者研究思路進(jìn)行解析：
基于LSCs的增殖極度依賴(lài)Tcf1和Lef1開(kāi)展的研究，尋找出具有殺傷LSCs的潛在藥物。
要完成這項(xiàng)工作，首先需要明確Tcf1和Lef1處于細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的特點(diǎn)，推測(cè)調(diào)控路徑；其次，需要尋找并設(shè)計(jì)調(diào)控的工具；需要根據(jù)前期的設(shè)計(jì)逐一條件進(jìn)行探索并證明。作者根據(jù)前期Tcf1/ Lef1的敲除技術(shù)以及病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，設(shè)計(jì)出HSPCs與LSCs的野生型與缺失型細(xì)胞，并通過(guò)RNA測(cè)序比較并解碼所轉(zhuǎn)錄的差異化基因來(lái)確定Tcf1/ Lef1特征性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，作者通過(guò)對(duì)比并選定對(duì)最具有差異化的AP-1家族基因進(jìn)行研究并通過(guò)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)LSCs中的Fosb和Fos的表達(dá)一致升高。
作者認(rèn)定針對(duì)Tcf1、Lef1下游基因進(jìn)行調(diào)控，一定程度上可以破壞LSCs的轉(zhuǎn)錄程序，進(jìn)而破壞LSCs細(xì)胞。于是從所表達(dá)的差異化基因中以轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)傳統(tǒng)、代謝等模擬Tcf1/ Lef1缺失所引起的小分子的變化；于是從CMAP中篩選出3種物質(zhì)，最終通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)篩選出了具有目標(biāo)功能的PGE1；并通過(guò)功能性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)伊馬替尼與PGE1具有協(xié)同作用；針對(duì)LSCs確實(shí)是有效果的。
為進(jìn)一步明確PGE1是針對(duì)LSCs，而非普通的CML，并確定治療效果，作者直接選定具有GFP標(biāo)記的LSCs進(jìn)行作用分析，作者將相同數(shù)量的LSCs注射到同源次級(jí)宿主中，并在沒(méi)有額外治療情況下檢測(cè)其存活。因?yàn)橐榴R替尼（IM）這種酪氨酸激酶抑制劑對(duì)LSCs敏感性較小，幾乎沒(méi)作用，可以看做基點(diǎn)；此時(shí)證實(shí)PGE1可有效抑制LSC得活性。
從功能上來(lái)講，針對(duì)CML的伊馬替尼與針對(duì)CML LSCs的PGE1是兩種不同的調(diào)控途徑，作者于是對(duì)調(diào)控途徑進(jìn)行了探索。
首先通過(guò)PGE1刺激LSCs進(jìn)行RNA測(cè)序分析以及RT-PCR分析所得的結(jié)果與前文一致，刺激后LSCs的Fosb, Fos和Egr1表達(dá)減少；并通過(guò)雙順?lè)醋硬《緦?shí)驗(yàn)證實(shí)Fosb, Fos的強(qiáng)制過(guò)量表達(dá)引起LSCs對(duì)PGE1不敏感。由于Fosb, Fos組合成AP-1行使其功能，這些數(shù)據(jù)表明AP-1因子是PGE1作用于LSCs的靶點(diǎn)。
PGE1作為小分子怎樣作用于AP-1？
根據(jù)分子構(gòu)效的比對(duì)了解到PGE1屬于E型前列腺受體的激動(dòng)劑，但此類(lèi)前列腺受體有4種，作者試想PGE1作用的受體會(huì)很容易檢測(cè)；于是作者取小鼠外周血，40mm過(guò)濾器過(guò)濾出BM單細(xì)胞懸浮液，使用熒光染料標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞表面的受體通過(guò)流式進(jìn)行檢測(cè)。
通過(guò)FACS分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EP1、EP3、EP4都能在LSCs上檢測(cè)到。
根據(jù)文獻(xiàn)總結(jié)，推斷PGE1最有可能作用于EP4，于是構(gòu)建了敲除EP4基因的細(xì)胞，此類(lèi)細(xì)胞得出的數(shù)據(jù)表明EP4剔除后移植后的同源小鼠死亡速度加快；盡管如此，作者承認(rèn)EP4是負(fù)責(zé)PGE1誘導(dǎo)LSCs的主要受體（如果不是唯一）。
作者用PKA抑制劑H89，MEK抑制劑PD98059，PI3K抑制劑Ly294002及鈣離子螯合劑BAPTA分別預(yù)處理LSCs細(xì)胞，然后用PGE1刺激這些細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PGE1誘導(dǎo)的Fos和Fosb不受PKA抑制劑的影響，但經(jīng)MEK、PI3K抑制劑及鈣離子螯合劑作用后，PGE1的作用出現(xiàn)了消除甚至逆轉(zhuǎn)；這說(shuō)明PGE1在LSCs中整合了多個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)通路調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。
最終文章我們把作者所描述的細(xì)胞激活通路簡(jiǎn)集匯總?cè)缦拢?/span>
首先PGE1作用于EP4，之后以不連接蛋白的方式作用于Tcf1、Lef1，進(jìn)而抑制LSC中的AP-1因子；另外，PGE1對(duì)MEK、PI3K及細(xì)胞內(nèi)Ca2 +的綜合信號(hào)通路，也被驗(yàn)證出可實(shí)現(xiàn)對(duì)AP-1因子的抑制。
這個(gè)治療能否用于臨床，作者通過(guò)患者治療的早晚期設(shè)計(jì)了兩種方案論證了針對(duì)CMLLSCS的PGE1單獨(dú)用于治療療效不顯著，但同樣能將Fosb, Fos表達(dá)降低，再次確認(rèn)了PGE1通過(guò)抑制AP-1來(lái)抑制CML LSCs的增殖，而且晚期患者仍然有效的抑制CML LSCs的增殖。
因?yàn)門(mén)KI的出現(xiàn)，CML常被認(rèn)為是“易于治療”的疾病，但因?yàn)長(zhǎng)SCs的存在，導(dǎo)致了終生對(duì)TKI的依賴(lài)，并且患者還存在對(duì)TKI耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)；而作者通過(guò)系統(tǒng)的探索尋找出攻克LSCs的方法，怎能不令人興奮，而且PGE1（前列地爾，現(xiàn)為血小板聚集抑制藥，已入藥典）的安全性已在臨床中被證明！文章唯一存在的疑惑是PGE1的受體是否僅為EP4，相信這個(gè)問(wèn)題會(huì)很快被解決。
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論文中使用Bioss抗體流式數(shù)據(jù)圖：
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2017年博奧森（Bioss）抗體高分引用文獻(xiàn)部分展示：
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